HIV

Nature Communications volume 14、記事番号: 4588 (2023) この記事を引用

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増殖感染に必要なヒト免疫不全ウイルス 1 (HIV-1) の核侵入のメカニズムは完全には理解されていません。今回我々は、VSV-Gと天然Envタンパク質でシュードタイプ化されたHIV-1に感染したHeLa細胞と活性化CD4+ T細胞において、エンドサイトーシスされたHIV-1を含むRab7+後期エンドソームが、核膜陥入（NEI）の形成を促進することを報告する。核外膜タンパク質 VAP-A、過剰リン酸化 ORP3、Rab7 から構成される VOR 複合体に関わる分子機構。 VAP-A または ORP3 のサイレンシング、および ORP3-VAP-A への Rab7 結合の薬物媒介障害により、HIV-1 成分の核移行と増殖性感染が阻害されました。 HIV-1 耐性の静止 CD4+ T 細胞では、ORP3 は過剰リン酸化されず、VOR 複合体も NEI も形成されませんでした。この新しい細胞経路とその分子プレーヤーは潜在的な治療標的であり、おそらくライフサイクルを完了するために核侵入を必要とする他のウイルスと共有されています。

現在の治療法により、HIV-1 誘発後天性免疫不全症候群 (AIDS) は管理可能な慢性疾患となっていますが、依然として世界的な健康上の優先事項です。治療法が利用できないことと薬剤耐性の発生は、より良い治療戦略を開発するには HIV-1 ライフサイクルのすべての段階を深く理解する必要があることを示しています。レトロウイルスの生活環の初期段階では、ウイルス成分を宿主 DNA に組み込むために細胞侵入と核コンパートメントへのアクセスが必要です。初期の研究では、細胞膜との直接融合による HIV-1 の pH 非依存性細胞侵入が支持されていました 1,2,3 が、細胞取り込み時のウイルスとエンドソーム膜の融合が示唆されている証拠が蓄積されています 4,5,6,7,8。例えば、水疱性口内炎ウイルス G (VSV-G) タンパク質による HIV-1 のシュードタイピングは、HIV-1 のエンドサイトーシス経路への侵入を標的とします 9,10。ダイナミンおよび Eps15 のトランスドミナントネガティブ変異体を適用することにより、ダイナミン依存性のクラスリン媒介エンドサイトーシスが CD4+ HeLa 細胞への生産的な HIV-1 侵入を引き起こす可能性があることが判明しました 11。エンドサイトーシスによる HIV-1 の細胞侵入は、リソソームコンパートメント内のウイルス成分の分解につながる行き止まりの経路とみなされたり考慮されたりしていますが 12、13 (参考文献 14 で概説)、それでもなお、エンドサイトーシスによる経路を決定づける可能性があります。大きな組み込み前核タンパク質複合体 (PIC) が核に到達し、核に入ります。実際、核内で複製する HIV-1 やその他のエンベロープウイルスについては、細胞型に依存する可能性があるその後の時空間的な細胞内ステップは不明であるか議論中です 15、16、17、18。ウイルスのカプシドの脱コーティングとウイルスゲノムの核への移入は、増殖性感染にとって重要です19。インポーチン 20,21 や核孔複合体 (NPC) の成分 22,23,24,25,26,27 などの宿主因子が、PIC の核侵入に潜在的に関与しています。最近、無傷の円錐形の HIV-1 カプシドが NPC 28、29 を通って輸送され、NPC 30、31 または核内でカプシドがコーティングされていないことが報告されました 32、33。 HIV-1 の核内輸送を阻害すると増殖性感染がブロックされるため、HIV ウイルスのライフサイクルのこの段階が薬剤の標的となる可能性があります。

我々は最近、エンドサイトーシスを受けた細胞外膜小胞（EV）からのタンパク質と核酸が核コンパートメントに到達し、遺伝子発現プロファイルや細胞運命を変化させる新規な細胞内経路を報告しました34,35。エンドサイトーシスを受けた EV の核小胞体 (NR)、特に II 型核膜陥入 (NEI) への侵入 36、およびその後の NPC を介した EV カーゴの核移植には、後期エンドソームの核外膜 (ONM) へのドッキングが必要です 34。このドッキングは、ONM 局在性小胞関連膜タンパク質 (VAMP) 関連タンパク質 A (VAP-A)、細胞質オキシステロール結合タンパク質 (OSBP) 関連タンパク質 3 (ORP3)、および後期エンドソーム関連低分子 GTPase Rab737。この経路は、OSBP ファミリーのメンバーである ORP3 に作用する FDA 承認の抗真菌薬イトラコナゾール (ICZ)38 によって遮断される可能性があります。 ORP3 は脂質、特に細胞小器官間の膜接触領域に見られるステロールの交換に関与しています 39,40,41。トロイの木馬エクソソーム仮説 42,43,44 で仮定されているように、エクソソーム経路とウイルスサイクルの間の相同性により、EV の核侵入経路がライフサイクルに核へのアクセスを必要とするウイルスに適用されるかどうかを調査することができました。今回我々は、VSV-G またはネイティブ Env でシュードタイプ化された HIV-1 が、HeLa 細胞または初代 CD4+ T 細胞に取り込まれた後、EV と同じ経路を使用してその内容物を宿主細胞の核に送達することを示します。このプロセスは化学物質によって遮断される可能性があります。薬物。

50 cells per experiment, n = 3). i–m Colocalization of IN-2 with Rab proteins. Experimental methodology (i). Cells were baculovirus infected to express Rab5/Rab7-RFP and then HIV-Gag-iGFP infected. At different times, cells were processed for ICC for HIV-1 IN and counterstained with DAPI. Noninfected cells expressing Rab5/7-RFP were analyzed (control). Composite images revealed colocalizations of IN-2 and Rab5-RFP (j white arrow) or Rab7-RFP (k green arrow) at early and late time points, which are rendered in a 3D image (l) and quantified using Pearson’s R correlation coefficient (m n = 25 cells per time point). We used a MOI of 2. In all cases, the means ± S.D. and, where appropriate, the individual values for each experiment are shown. P values are indicated. Scale bars, 2 (l), 5 (a, b), 10 (e, g, j, k) µm./p>35% in scrambled shRNA or VAP-B-deficient cells (Fig. 3f, g), supporting the idea that the integrity of the VOR complex is necessary for this process. Raising the number of MOI (e.g., 8 instead of 2) partially increased the number of GFP+ cells in VAP-A-deficient cells from 4.56 ± 2.03% to 8.07 ± 1.71%, which is lower than the corresponding number in scrambled shRNA, 48.81 ± 4.82%, but in line with the remaining amount of VAP-A (Supplementary Fig. 5a)./p>math>gamma function in Fiji. For 3D image reconstruction, z stacks of entire cells at 0.3-µm per slice were acquired, and the images were rendered in 3D using Imaris software (version 9.6, Bitplane, Concord, MA)./p>

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