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Scientific Reports volume 13、記事番号: 11652 (2023) この記事を引用

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8 オルトメトリック

メトリクスの詳細

CRISPR ゲノム編集は、生物学的機能を解明するための強力なツールです。 意図したとおりにゲノムを改変するには、起こり得るさまざまな組換え様式を理解することが不可欠です。 この研究では、マイクロホモロジー媒介末端結合 (MMEJ) を使用した CRISPR 編集による条件付き対立遺伝子の生成中に同定された複雑なベクター挿入を報告します。 ターゲティング ベクターには、2 つの loxP 配列と隣接する 40 bp のマイクロホモロジーが含まれていました。 loxP 配列に対応するゲノム領域は、マウス胚性幹細胞の Cas9 で切断されました。 標的組換えの PCR スクリーニングにより、予想よりも大きなサイズのバンドが高頻度で存在することが明らかになりました。 これらのバンドのナノポア配列決定により、クローンの少なくとも 17% において、MMEJ だけでなく非相同末端結合および相同組換えによっても媒介される複雑なベクター挿入が明らかになりました。 PCR 条件を改善すると新しいバンドが現れ、標準的な PCR スクリーニングを回避する意図せずに修飾された対立遺伝子の存在が示唆されました。 これにより、ヘテロ接合性一塩基多型を使用してゲノム編集クローンの各対立遺伝子の組換えを特徴づけることができ、ホモ接合性対立遺伝子の存在が確認されました。 私たちの研究は、複雑で意図しないオンターゲットのベクター挿入を排除するには、ゲノム編集クローンの慎重な品質管理が必要であることを示しています。

近年、ゲノム改変技術は CRISPR システムの登場により大きく進歩しました1。 ただし、CRISPR ゲノム編集では、意図しない組換えが発生する可能性が常にあります。 したがって、ゲノム編集クローンの品質管理は、クローンにおける意図した組換えが意図しない組換えを伴わないようにするために重要です。 意図しない組換えは、組換えの標的部位、または標的部位から離れたゲノム領域で起こる可能性があります。 後者のタイプの組換えは、ガイド RNA (gRNA) の部分的なアニーリングにより、標的配列に類似したゲノム配列で起こることがよくあります。 このような組換えは「オフターゲット」効果と呼ばれ、それを検出するためにさまざまな方法が開発されています2,3。 前者の意図しない「オンターゲット」組換えに関しては、標的部位全体にわたる大規模な欠失が報告されています4、5、6、7。 通常、目的の組換え体は PCR によってスクリーニングされます。 したがって、PCR プライマー結合部位の喪失に伴う大きなゲノム欠失は気付かれない可能性があります。 最近、gRNA ベクターまたはミトコンドリア DNA が標的ゲノム切断部位に挿入される、他のタイプの意図しないオンターゲット組換えが報告されています 8。 これらの場合、PCR プライマー結合部位は保存されていましたが、PCR アンプリコン サイズが検出限界を超えていたため、意図しない外来配列の挿入は最初の PCR スクリーニングでは気づかれませんでした。 このような意図しないオンターゲット組換えは、特に両対立遺伝子のゲノム編集を目的とする場合、慎重に調べる必要があります。PCR 分析で確認された野生型 (wt) 対立遺伝子の喪失は、ホモ接合性ゲノム編集ではなく、意図した遺伝子の組み合わせによって引き起こされる可能性があるためです。一方の対立遺伝子での組換えと、もう一方の対立遺伝子での意図しない組換えです。

本研究では、培養細胞における Cre/loxP システムの条件付き対立遺伝子の生成過程で特定した、意図しない複雑なオンターゲット ベクター挿入パターンについて報告します。 条件付き対立遺伝子を生成するには、2 つの loxP 配列 (1 つはターゲット ゲノム領域の上流に、もう 1 つは下流) を挿入する必要があります。 さらに、培養細胞で表現型解析を行うには、両方の対立遺伝子を同じ方法で修飾する必要があります。 したがって、合計 4 つの loxP 部位をゲノムに挿入する必要があります。 相同組換え (HR)、非相同末端結合 (NHEJ)、および微小相同性媒介末端結合 (MMEJ) などのさまざまな修復経路を利用して、ゲノムに外来配列を導入できます。 HR は最も広く使用されている経路であり、ターゲティングベクターに 500 ～ 1000 bp の相同アームが必要です9。 HR 経路は、主に細胞周期の S 期後期から G2 期まで活性化すると報告されています 10。 対照的に、NHEJ 経路は細胞周期全体を通じて活性です 10。 したがって、NHEJ ベースの方法では、HR11 と比較して組換え部位の接合配列の制御が困難であるにもかかわらず、HR 方法が非効率であるニューロンなどの細胞種への標的挿入が可能になります。 最近では、MMEJ を使用した PITCh (Precise Integration into Target Chromosome) システムと呼ばれる方法が開発されました 12,13。 この方法では、長さ 10 ～ 40 塩基という短いマイクロホモロジー アームを組換えに利用します。 MMEJ 経路は主に M 期から S 期初期まで活性であることが報告されており 14、HR とは異なる組換え様式を可能にします。 ターゲティングベクターのホモロジーアームの長さが短いため、ゲノムへの34塩基のloxP配列の挿入はPCRによって容易に検出できるため、本研究ではPITCh法を採用しました。 しかし、PCR スクリーニングにより、高頻度で予想よりも長い、意図しないサイズのバンドが明らかになりました。 Nanopore ロングリード シークエンシングによるこれらのバンドの解析により、MMEJ だけでなく HR および NHEJ も関与する複雑なベクター挿入が明らかになりました。 挿入されたベクター配列のサイズは、ゲノム編集クローンの標準的な PCR ベースの品質管理法の検出限界を超える可能性があります。 私たちは、この研究で検出された意図しないオンターゲット組換えは、ゲノム編集の品質管理段階で慎重に除外する必要があると提案します。